2019, Vol. 55
2. 青岛大学基础医学院生理学教研室，山东 青岛 266071
Nesfatin-1是由日本群马大学OH等[1]发现的一种脑肠肽。作为一种厌食肽，Nestatin-1在大鼠的摄食和能量代谢中发挥重要作用[2]，并且Nesfatin-1参与调节糖代谢[3-5]。既往研究表明，除广泛分布于外周外，Nesfatin-1阳性神经元还分布于室旁核(PVN)、视上核(SON)、弓状核(ARC)、腹内侧核(VMH)、下丘脑外侧区(LHA)、迷走神经复合体(DVC)、孤束核(NTS)等多个中枢核团[6-7]。最新研究发现，小鼠和大鼠的外侧臂旁核(LPBN)中也有Nesfatin-1阳性神经元的分布[8-9]。有Meta分析结果表明，随着糖尿病进展，血浆中Nesfatin-1表达水平下降。这与糖尿病病人低糖血症反向调节(CRR)受损的发病过程相一致，提示Nesfatin-1的减少可能为CRR受损的机制之一[10]。BONNET等[11]研究证实，在胰岛素和2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)诱导的低糖血症模型鼠中，PVN、迷走神经运动背核(DMN)和NTS等核团中Nesfatin-1阳性神经元被激活。新近研究表明，在胰岛素和2-DG诱导的低糖血症模型鼠中，LPBN中CCK神经元被激活，并投射到下丘脑VMH，通过类固醇生成因子-1神经元发挥作用，证实LPBN在CRR中扮演重要角色[12]。本实验室已经证实LPBN注射Nesfatin-1可以抑制大鼠夜间摄食[13]，但Nesfatin-1能否作用于LPBN并参与CRR还不清楚。本实验旨在探究LPBN注射Nesfatin-1对大鼠CRR的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物成年雄性Wistar大鼠40只，体质量270~310 g，购于青岛市药品检验所。所有大鼠饲养于标准化动物房(温度为(23±2)℃，7:00~19:00光照环境)，自由饮水和进食。适应环境1周后开始实验。
1.1.2 药品及试剂Nesfatin-1与Nesfatin-1一抗(兔来源)均购于美国Phoenix公司，山羊抗兔二抗IgG购于北京中杉金桥公司，绵羊来源c-fos一抗购于美国Millipore公司，驴抗绵羊二抗购于R&D公司，门冬胰岛素注射液(笔芯)为诺瑞诺德公司产品，生理盐水(NS)购于青岛大学校医院，水合氯醛为天津市瑞金特化学品有限公司产品。
1.2 实验方法 1.2.1 Nesfatin-1阳性神经元与c-fos免疫阳性神经元共表达实验取8只大鼠，随机分为对照组和胰岛素组，每组4只。于实验前1 d的21:00开始禁食，允许自由饮水。实验当天9:00开始腹腔给药，胰岛素组用胰岛素笔腹腔注射胰岛素(10 U/kg)，对照组腹腔注射NS。分别于给药0、30、60、90、120 min时检测血糖水平。给药2 h后腹腔注射80 g/L水合氯醛麻醉，10 min后行心脏灌注术，迅速断头取脑组织，将其置于40 g/L多聚甲醛溶液中4 ℃冰箱固定24 h，用300 g/L蔗糖溶液4 ℃脱水24 h。切取LPBN的脑组织行冷冻切片，切片厚度为10~15 μm，将切片置于载玻片上。切好的脑片于60 ℃烤箱烤片4 h后，浸泡于PBST溶液中，20 min后置于修复液内，应用微波炉95 ℃中火修复抗原10 min，待自然冷却后以PBST溶液冲洗3次，小牛血清封闭液室温封闭2 h，Nesfatin-1抗体(兔抗大鼠，1：500)与c-fos抗体(绵羊抗大鼠，1：250)4 ℃孵育脑片72 h，用PBST溶液冲洗3次，Nesfatin-1二抗(山羊抗兔，1：100，绿色荧光)与c-fos二抗(驴抗绵羊，1：200，红色荧光)室温孵育2 h，以PBST溶液洗片后，用封片液(PBST：甘油=1：1)封片固定脑片。在荧光显微镜下观察Nesfatin-1及c-fos的表达，应用Image Pro Plus软件对视野内所有阳性细胞进行计数。
1.2.2 LPBN注射Nesfatin-1对血糖影响实验取剩余32只大鼠，腹腔注射80 g/L水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠，将其固定于立体定位仪上[14]，并参照坐标将留置套管埋入LPBN[15-16]。大鼠LPBN埋管后休息1周开始实验。将大鼠随机分为低剂量胰岛素+NS组(A组，n=6)、低剂量胰岛素+Nesfatin-1组(B组，n=6)、高剂量胰岛素+NS组(C组，n=10)和高剂量胰岛素+Nesfatin-1组(D组，n=10)。所有大鼠实验前1 d的21:00开始禁食，实验当天8:50腹腔注射胰岛素(10或15 U/kg)或NS后，9：00分别在LPBN缓慢注射Nesfatin-1(50 pmol)和NS 0.5 μL(剂量参考相关文献[14, 17-18])，停留2 min后拔针(注射针比外管长0.8 mm)。用采血针经尾静脉采血，检测LPBN给药后0、30、60、90、120 min时的血糖。实验后的大鼠经埋管LPBN注射滂胺天蓝2 μL，取脑组织制备15 μm厚的冷冻切片。在光镜下观察滂胺天蓝注射标记点的位置，定位准确的样本纳入统计。
1.3 统计学方法应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，所得计量资料数据以x±s形式表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 低糖血症对LPBN中Nesfatin-1与c-fos共表达的影响与对照组相比较，胰岛素组大鼠腹腔注射胰岛素后15、30、60、90、120 min时的血糖水平明显降低(t=8.450~16.130，P＜0.05)。见表 1。胰岛素组大鼠LPBN的Nesfatin-1阳性神经元与c-fos免疫阳性神经元共表达明显高于对照组(10.4±1.7 vs 6.9±3.2；t=3.044，P＜0.05)。
| 表 1 两组大鼠腹腔注射胰岛素不同时点血糖水平比较(n=4，c/mmol·L-1，x±s) |
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LPBN给药后90、120 min时，低剂量胰岛素+Nesfatin-1组血糖水平明显高于低剂量胰岛素+NS组(t=2.433、3.045，P＜0.05)；LPBN给药后30、60 min时，高剂量胰岛素+Nesfatin-1组血糖水平明显高于高剂量胰岛素+NS组(t=2.967、3.546，P＜0.05)；LPBN给药后30 min时，高剂量胰岛素+Nesfatin-1组大鼠血糖水平明显高于低剂量胰岛素+Nesfatin-1组(t=4.363，P＜0.01)。见表 2。
| 表 2 各组大鼠LPBN给药后不同时点血糖水平比较(c/mmol·L-1，x±s) |
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位于脑桥的LPBN是连接前脑(下丘脑)和后脑(脑干)的中继核团，主要负责能量平衡相关信号的上传下达[19-20]。健康群体低糖血症时，可以通过神经-体液机制激活CRR，维持糖代谢的稳态：一方面通过刺激交感神经[21]，产生觉醒、饥饿、心悸、震颤、出汗等症状；另一方面可通过增加血浆中升糖激素(胰高血糖素、皮质醇和肾上腺素)的水平和减少胰岛素的分泌，增加肝脏的糖原分解和糖异生，共同维持血糖稳态[22]。然而这些生理调节在1型糖尿病病人中常常减弱或消失[23]。而严重低糖血症可以导致脑细胞不可逆性损害、心律失常、急性心肌梗死甚至死亡[24]。因此，预防低糖血症的发生成为糖尿病病人治疗过程中最重要的环节之一。
脑桥LPBN已被证实参与CRR调节，并且无论是外周低糖血症还是中枢低糖血症均可激活下丘脑Nesfatin-1阳性神经元[11]。但是Nesfatin-1能否作用于LPBN增强CRR的研究仍为空白。本实验主要探究了LPBN中Nesfatin-1对于CRR的作用，结果显示，低糖血症可激活LPBN中Nesfatin-1阳性神经元，提示在LPBN中Nesfatin-1可以参与CRR，并且LPBN注射Nesfatin-1可明显改善腹腔注射不同剂量胰岛素所致低糖血症状态，但是Nesfatin-1并不能完全逆转高剂量胰岛素(15 U/kg)所致严重低糖血症。现普遍认为，葡萄糖敏感性神经元在CRR中起关键作用[25]。该类神经元能够感受细胞外葡萄糖浓度的波动，依据其对不同浓度葡萄糖的反应性可分为葡萄糖兴奋性神经元(GE神经元)和葡萄糖抑制性神经元(GI神经元)[26]。GI神经元是感受低糖血症状态重要神经元，在葡萄糖缺乏时其放电频率增加，下丘脑和脑干等的多个脑区(如PVN、ARC、VMH、DVC及LPBN)内的GI神经元均可直接感受低糖血症刺激[12, 14, 17]。新近研究显示，通过改善VMH中GI神经元对低糖血症的敏感性，可改善CRR[27]，提示改善GI神经元对低糖血症敏感性是防治CRR受损的重要机制之一。本实验中LPBN注射Nesfatin-1后30 min，高剂量胰岛素+Nesfatin-1组血糖水平明显高于低剂量胰岛素+Nesfatin-1组，而其他时点两组比较差异无显著性。这可能是由于腹腔注射高剂量胰岛素后，血糖迅速下降，GI神经元及时接收到血糖降低的信号使血糖水平升高，但是在腹腔注射胰岛素90 min以后，胰岛素持续发挥降血糖作用并且该作用强于Nesfatin-1升血糖的作用；而腹腔注射低剂量胰岛素时，只有血糖持续降低到一定水平(本实验结果显示是在90 min时)Nesfatin-1才发挥作用。本课题组前期实验结果显示，PVN、LHA、VMH和DVC微量注射Nesfatin-1可显著提高GI神经元的兴奋性[14, 17]。2014年，GARFIELD等[12]证实LPBN中的CCK神经元参与CRR。本课题组最新研究表明，Nesfatin-1能够提高LPBN中GI神经元的放电频率[13]。本实验结果显示，低糖血症可激活LPBN中的Nesfatin-1阳性神经元。通过LPBN微量注射Nesfatin-1进一步研究表明，Nesfatin-1可以增强CRR，但是Nesfatin-1并不能完全逆转高剂量胰岛素造成的严重低糖血症状态。鉴于中枢神经系统中葡萄糖敏感性神经元与CRR的密切联系，我们认为Nesfatin-1可能通过影响LPBN中葡萄糖敏感性神经元的兴奋性增强CRR这一过程。由于本实验纳入的大鼠数目较少，加之Nesfatin-1受体至今未明确，这在一定程度上限制了我们对Nesfatin-1参与CRR机制的探讨。同时，本实验也缺乏直接的电生理证据表明Nesfatin-1可以影响低糖血症条件下LPBN中GI神经元的放电频率。
综上所述，低糖血症可激活LPBN中的Nesfatin-1阳性神经元，并且LPBN注射Nesfatin-1可以增强CRR，这可能是通过增强GI神经元的敏感性实现的。本文结果为进一步探究LPBN中Nesfatin-1防治糖尿病病人低血糖症等相关并发症提供了一定的实验参考。
| [1] |
OH I S, SHIMIZU H, SATOH T, et al. Identification of nesfatin-1 as a satiety molecule in the hypothalamus[J]. Nature, 2006, 443(7112): 709-712. DOI:10.1038/nature05162 |
| [2] |
WERNECKE K, LAMPRECHT I, JOEHREN O, et al. Nesfatin-1 increases energy expenditure and reduces food intake in rats[J]. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 2014, 122(3): 1662-1668. |
| [3] |
SU Yijing, ZHANG Jing, TANG Yanchun, et al. The novel function of nesfatin-1: anti-hyperglycemia[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010, 391(1): 1039-1042. DOI:10.1016/j.bbrc.2009.12.014 |
| [4] |
BUTLER A A. More news about NUCB2/nesfatin-1: a new factor in the hypothalamic control of glucose homeostasis?[J]. Diabetes, 2012, 61(8): 1920-1922. DOI:10.2337/db12-0576 |
| [5] |
AYADA C, TORU U, KORKUT Y. Nesfatin-1 and its effects on different systems[J]. Hippokratia, 2015, 19(1): 4-10. |
| [6] |
KOHNO D, NAKATA M, MAEJIMA Y, et al. Nesfatin-1 neurons in paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus coexpress oxytocin and vasopressin and are activated by refeeding[J]. Endocrinology, 2008, 149(3): 1295-1301. DOI:10.1210/en.2007-1276 |
| [7] |
MORTON K A, HARGREAVES L, MORTAZAVI S, et al. Tissue-specific expression and circulating concentrations of nesfatin-1 in domestic animals[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2018, 65: 56-66. DOI:10.1016/j.domaniend.2018.04.006 |
| [8] |
GOEBEL M, STENGEL A, WANG L, et al. Nesfatin-1 immunoreactivity in rat brain and spinal cord autonomic nuclei[J]. Neuroscience Letters, 2009, 452(3): 241-246. DOI:10.1016/j.neulet.2009.01.064 |
| [9] |
GOEBEL-STENGEL M, WANG L X, STENGEL A, et al. Localization of nesfatin-1 neurons in the mouse brain and functional implication[J]. Brain Research, 2011, 1396: 20-34. DOI:10.1016/j.brainres.2011.04.031 |
| [10] |
ZHAI Ting, LI Shizhen, FAN Xintong, et al. Circulating nesfatin-1 levels and type 2 diabetes: a systematic review and Meta-analysis[J]. Journal of Diabetes Research, 2017, 2017: 7687098. |
| [11] |
BONNET M S, DJELLOUL M, TILLEMENT V, et al. Central NUCB2/nesfatin-1-expressing neurones belong to the hypothalamic-brainstem circuitry activated by hypoglycaemia[J]. Journal of Neuroendocrinology, 2013, 25(1): 1-13. |
| [12] |
GARFIELD A S, SHAH B P, MADARA J C, et al. A parabrachial-hypothalamic cholecystokinin neurocircuit controls counterregulatory responses to hypoglycemia[J]. Cell Metabolism, 2014, 20(6): 1030-1037. DOI:10.1016/j.cmet.2014.11.006 |
| [13] |
YUAN Junhua, CHEN Xi, DONG Jing, et al. Nesfatin-1 in the lateral parabrachial nucleus inhibits food intake, modulates excitability of glucosensing neurons, and enhances UCP1 expression in brown adipose tissue[J]. Frontiers in Physiology, 2017, 8: 235. DOI:10.3389/fphys.2017.00235 |
| [14] |
DONG Jing, GUAN Hongzai, JIANG Zhengyao, et al. Nesfatin-1 influences the excitability of glucosensing neurons in the dorsal vagal complex and inhibits food intake[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98967. DOI:10.1371/journal.pone.0098967 |
| [15] |
KHAZIPOV R, ZAYNUTDINOVA D, OGIEVETSKY E A, et al. Atlas of the postnatal rat brain in stereotaxic coordinates[J]. Frontiers in Neuroanatomy, 2015, 9: 161. |
| [16] |
YANG Pengfei, WANG Zhenzhen, ZHANG Zhao, et al. The extended application of the rat brain in stereotaxic coordinates in rats of various body weight[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2018, 307: 60-69. DOI:10.1016/j.jneumeth.2018.06.026 |
| [17] |
CHEN Xi, DONG Jing, JIANG Zhengyao. Nesfatin-1 influences the excitability of glucosensing neurons in the hypothalamic nuclei and inhibits the food intake[J]. Regulatory Peptides, 2012, 177(1/3): 21-26. |
| [18] |
CHEN Xi, SHU Xin, CONG Zhukai, et al. Nesfatin-1 acts on the dopaminergic reward pathway to inhibit food intake[J]. Neuropeptides, 2015, 53: 45-50. DOI:10.1016/j.npep.2015.07.004 |
| [19] |
CARTER M E, SODEN M E, ZWEIFEL L S, et al. Genetic identification of a neural circuit that suppresses appetite[J]. Nature, 2013, 503(7474): 111-114. DOI:10.1038/nature12596 |
| [20] |
WU Q, CLARK M S, PALMITER R D. Deciphering a neuronal circuit that mediates appetite[J]. Nature, 2012, 483(7391): 594-597. DOI:10.1038/nature10899 |
| [21] |
JOKIAHO A J, DONOVAN C M, WATTS A G. The rate of fall of blood glucose determines the necessity of forebrain-projecting catecholaminergic neurons for male rat sympathoadrenal responses[J]. Diabetes, 2014, 63(8): 2854-2865. DOI:10.2337/db13-1753 |
| [22] |
SPRAGUE J E, ARBELAEZ A M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia[J]. Pediatric Endocrinology Reviews: PER, 2011, 9(1): 463-473. |
| [23] |
UMPIERREZ G, KORYTKOWSKI M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia[J]. Nature Reviews Endocrinology, 2016, 12(4): 222-232. DOI:10.1038/nrendo.2016.15 |
| [24] |
AWONIYI O, REHMAN R, DAGOGO-JACK S. Hypoglycemia in patients with type 1 diabetes: epidemiology, pathogenesis, and prevention[J]. Current Diabetes Reports, 2013, 13(5): 669-678. DOI:10.1007/s11892-013-0411-y |
| [25] |
ROUTH V H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?[J]. Physiology & Behavior, 2002, 76: 403-413. |
| [26] |
CRYER P E. Elimination of hypoglycemia from the lives of people affected by diabetes[J]. Diabetes, 2011, 60(1): 24-27. DOI:10.2337/db10-1359 |
| [27] |
ZHOU C, ROUTH V H. Thioredoxin-1 overexpression in the ventromedial nucleus of the hypothalamus preserves the counterregulatory response to hypoglycemia during type 1 diabetes in male rats[J]. Diabetes, 2018, 67(1): 120-130. DOI:10.2337/db17-0930 |