帕金森病(PD)是全球第二大神经退行性疾病，其运动症状主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势不稳^[1]。PD病人黑质(SN)致密部的多巴胺(DA)能神经元进行性丢失，出现以α-突触核蛋白(α-syn)为主要成分的路易小体(LB)^[2-3]。α-syn由140个氨基酸组成，参与DA合成、重摄取和突触DA囊泡的转运等功能^[4]。α-syn构象的改变会引起DA能神经元的死亡^[5-6]，可能与运动功能障碍有关^[7]，但引起α-syn错误折叠的原因尚不明确^[8]。近年来，与α-syn相关的PD动物模型成为大家关注的焦点。A53T转基因小鼠作为一种常用的高表达人源性α-syn的PD模型小鼠，可以在一定程度上模拟一些与PD相关的神经病理学和行为学特征^[9-11]，但是，A53T基因在小鼠体内并不仅在PD相关脑区表达^[12]。近年来，通过注射腺相关病毒(AAV)使其在目的脑区表达已经得到了大家广泛的认可，AAV-α-syn动物模型也越来越多地被应用于PD研究中^[13-16]。本研究通过将AAV2/9-α-syn注射到小鼠双侧SN中来研究过表达α-syn对小鼠运动行为的影响。现将结果报告如下。

SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠40只，购于北京维通利华实验技术有限公司，饲养于清洁的小鼠房内，每笼4只，保证室温(21±2)℃、湿度(50±5)%、12/12 h昼夜循环光照，小鼠可自由饮水、取食。AAV由和元生物技术(上海)股份有限公司生产，实验组病毒为AAV2/9-α-syn，滴度为1.65×10¹⁶V.G./L，对照组病毒为AAV2/9-EGFP，滴度为9.95×10¹⁵V.G./L，经公司检测均可以正常表达。α-syn抗体为美国CST公司产品，β-actin抗体为中国博奥森公司产品。

待小鼠适应环境1周后，将其随机平均分为2组。利用瑞沃德公司的呼吸麻醉机将其深度麻醉后，迅速取出固定在小鼠立体定位仪上，同时用异氟烷给予持续麻醉。将小鼠用耳杆适配器固定好，使其头部平整，耳杆左右读数相同，暴露出小鼠颅骨，参照第2版小鼠脑立体定位图谱，定位并读出前囟坐标，在三维推动器的引导下至SN区，其坐标为前囟后－3.1 mm、旁开±1.4 mm、深度－4.4 mm^[17]。两组小鼠均采用微量注射泵在两侧SN注射200 nL病毒，流量为0.5 nL/s，注射结束后留针10 min再缓慢退针，病毒注射4周后对小鼠进行行为学检测。

行为学实验结束后，每组取10只小鼠，用异氟烷深度麻醉后在冰上迅速断头取脑，取出SN后加入蛋白裂解液研磨均匀于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，取上清，用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉将切出的目的条带在摇床上室温封闭2 h后，分别用α-syn(1：1 000)和β-actin(1：10 000)的一抗于4 ℃在摇床上孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min，再用山羊抗兔(1：10 000)二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后用ECL发光液孵育1 min，用LSUVP Vision Works^TM LS软件显影后进行统计分析。

使用美国Med Associates，Inc.公司的转棒仪检测小鼠运动协调能力。先将小鼠面对墙壁放在静止的转棒仪上适应2 min，适应结束后，将转棒仪转速设置为4~40 r/min，匀加速转动5 min。实验开始后，小鼠会随着转棒仪转动连续奔跑或掉落下来，5 min后转棒仪自动停止转动，系统可记录小鼠在转棒仪上停留的时间。采用非连续性测量法，测定2次，时间间隔2 h，最后取2次测量的平均值。

取一根长0.5 m、直径1 cm的木杆，在木杆顶部固定一个直径为2.5 cm的塑料球，并在木杆外表面缠满纱布防止小鼠打滑。于实验前1 d训练小鼠使其能够在杆上爬行。实验时，将小鼠头部向上贴近塑料球，使其身体自然下垂，开始计时。分别记录小鼠头部向下、后肢到达塑料球处和小鼠四肢全部到达地面的时间，作为小鼠的爬杆调头时间和总时间。每隔20 min检测1次，取5次检测的平均值，如果小鼠中间向上调头爬行或停止爬行，则重新进行检测。

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料结果以x±s形式表示，两独立样本均数比较采用Student’s t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

实验组与对照组小鼠SN区α-syn表达水平分别为1.218±0.114和0.697±0.140，实验组小鼠SN区的α-syn表达明显增加，差异有统计学意义(t=2.803，P＜0.05)。

转棒实验结果显示，对照组小鼠和实验组小鼠在转棒仪上停留的时间分别为(178.40±19.04)和(128.80±13.23)s，实验组小鼠在转棒仪上停留的时间较对照组小鼠明显缩短(t=2.177，P＜0.05)。爬杆实验结果显示，对照组和实验组小鼠爬杆所用总时间分别为(8.76±0.41)和(15.26±0.64)s，调头时间分别为(1.59±0.10)和(3.32±0.14)s，实验组小鼠爬杆所用总时间和调头时间均较对照组明显增加(t=8.045、9.401，P＜0.01)。

PD是一种多发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，遗传因素、环境因素、氧化应激以及炎症因素等均可参与PD的发病^[18]。路易小体的出现是PD的病理特征之一，而聚集的α-syn是路易小体的主要成分。本实验对C57BL/6J小鼠双侧SN定向注射AAV2/9-α-syn后，通过转棒实验和爬杆实验研究小鼠SN内过表达α-syn对运动功能的影响。爬杆实验结果显示，与对照组相比，实验组小鼠爬杆所用总时间与调头时间均明显增加；转棒实验结果显示，与对照组相比，实验组小鼠在转棒仪上停留的时间明显缩短。上述实验结果均表明SN区过表达α-syn会使小鼠运动协调能力下降，出现明显的运动功能障碍。

运动不能、肌僵直、静止性震颤和姿势反射障碍是PD病人常见的运动症状，而α-syn异常聚集产生的毒性会造成运动功能障碍与神经变性^[17]。有文献报道，过表达α-syn小鼠表现出运动功能障碍、纹状体DA丧失和神经变性^[19-21]。此外有研究观察到，(Thy1)-h[A30P]-αSyn转基因小鼠出现早期中枢神经系统运动障碍^[22]。本研究结果显示，在小鼠SN内注射AAV2/9-α-syn 4周后，小鼠SN区α-syn蛋白的表达量明显上升，同时小鼠出现了明显的运动功能障碍。在AAV-α-syn过表达模型中，运动损伤的出现时间和损伤程度在不同的研究中有所差异^{[21, 23]}。通常，SN区单侧注射AAV-α-syn被更广泛地应用于PD研究中，但是，与单侧注射相比，SN区双侧注射AAV-α-syn会导致更明显的病理学特征与运动功能障碍^[24-29]。有研究结果显示，在大鼠SN区注射AAV6-α-syn后，囊泡单胺转运蛋白2、多巴胺转运体和酪氨酸羟化酶表达均降低30%~50%^[30]，这提示α-syn的过表达会导致DA合成和释放的普遍下调，进而影响运动功能。α-syn的突变与过表达也可引起线粒体功能障碍和氧化应激等^[31-32]，但SN区注射AAV-α-syn后是否存在线粒体功能障碍与氧化应激的改变还有待进一步研究。

综上所述，小鼠SN区双侧注射AAV2/9-α-syn 4周会引起其SN区α-syn表达增加，小鼠出现运动功能障碍。